FISH
Heute werden ISH Experimente praktisch nur noch mit nicht-radioaktiv markierten DNA-Sonden durchgeführt und als Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) bezeichnet.
Es sind klare und starke Signale nach Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die mit Texas Red markiert wurde, proximal auf dem Chromosom 1 (BTA 1) zu sehen. Diese DNA-Sonde hybridisiert in der Nähe des Genorts für Hornlosigkeit. Die Chromosomen wurden mit DAPI (blaue Färbung) angefärbt.
Interphasen-FISH
Eine Alternative zur Hybridisierung mit Metaphasen-Chromosomen ist die Hybridisierung auf Interphasen-Zellkernen. Dazu eignen sich beispielsweise Mundschleimhautabstriche sehr gut. Die Epithelzellen des Abstrichs werden auf einen Objektträger gebracht, fixiert und die DNA der Zellkerne denaturiert. Im Gegensatz zu den Metaphasen, ist die DNA der Interphasen-Zellkerne nicht kompaktiert. Trotzdem können die Signale (grün und pink) erkannt werden (siehe Abbildung 11 unten).
Double FISH
Für ein Double-FISH Experiment benötigen wir zwei DNA-Sonden, die vorgängig unterschiedlich markiert worden sind. Der Ablauf der Hybridisierung ist genau gleich wie bei einem normalen FISH-Experiment. Die DNA-Sonde kann dabei auf ein Einzelgen oder auf ein ganzes Chromosom gerichtet sein.
Resultate eines Double-FISH Experiments für eine Metaphase (rechts oben) und für einen Interphase-Zellkern (links unten). Mit Texas Red und FITC (Fluorescein-isothiocyanat) markierte Chromosomen-Painting Proben decken das ganze X Chromosom bzw. Y Chromosom des Haushundes ab. In der Metaphase leuchten das X Chromosom und das Y Chromosom pink bzw. grün auf. Im Interphasenkern identische Situation.
Fiber FISH
Für eine FIBER-FISH (Abbildung 12) werden die Chromatinfäden (DNA) vor der Hybridisierung mechanisch künstlich gestreckt, indem man Gravitationskraft einwirken lässt. Damit kann die Auflösung der Analyse auf 1‘000 Basenpaare erhöht werden.
In der Mitte sieht man eine von vielen Chromatin-Fibern. Grünes Signal zeigt eine bovine DNA-Sonde auf dem Rinderchromosom 3.
Chromosomen-Painting
Eine Chromosomen-Painting-Probe ist ein Sonden-Gemisch von markierten DNA-Molekülen, die das gesamte Chromosom abdecken (siehe Abbildung 13). Um eine Chromosomen-Painting Probe herzustellen wird das Chromosom, für das man die Chromosomen-Painting Probe herstellen will, entweder durch ein sogenanntes Flow-Sorting-Verfahren oder nach Mikro-Dissektion von mehreren Kopien aus Metaphasen angereichert. Die so angereicherten DNA-Moleküle müssen mit Hilfe einer speziellen PCR (Degenerate-Oligonucleotide-PCR [=DOP-PCR]) angereichert und markiert werden. Chromosomen-Painting Proben erleichtern die Diagnostik. In Figur ist der Einsatz einer X Chromosomen-Painting Probe des Pferdes dargestellt.
Die X Chromosomen sind sehr leicht zu identifizieren.
Multicolor FISH (M-FISH)
Multicolor-FISH oder zu Deutsch "Vielfarb-Chromosomen-FISH" ist eine Technik, die zurzeit nur für wenige Arten (z.B. Mensch, Maus, Ratte) kommerziell verfügbar ist. Das Sonden-Gemisch enthält Chromosomen-Painting Proben für alle Chromosomen einer Spezies. Diese werden simultan hybridisiert und durch geschickte computergestützte Analysen können so unterschiedliche Farbimages für jedes homologe Chromosomenpaar erstellt werden. Diese Methode eignet sich sehr gut um einfache und komplexe strukturelle und numerische Chromosomen-Veränderungen nachzuweisen.
Auf der linken Seite der Abbildung ist eine Metaphase aus murinen embryonalen Stammzellen zu sehen, die mit DAPI angefärbt wurde. Auf der rechten Seite ist dieselbe Metaphase, aber nach M-FISH-Experiment zu sehen. Es sind Aneuploidien und Trisomien sichtbar.
Es sind Monosomien und Trisomien zu sehen.