Herstellung einer Chromosomen-Präparation
Damit Chromosomen untersucht werden können, muss geeignetes Probenmaterial zur Verfügung stehen, das für die Chromosomen-Präparation verwendet wird. Schon die Probenentnahme kann einen grossen Einfluss auf die Qualität der Chromosomen haben. Folgende Punkte sind wichtig:
- Die Probenentnahme sollte so steril wie möglich erfolgen!
- Es muss zwingend eine Heparin-Blutprobe eingeschickt werden!
- Es sollten vor der Blutentnahme keine Medikamente (auch Mittel zur Sedation) verabreicht werden!
- Sind bereits Medikamente gegeben worden, muss das vermerkt werden!
- Blut von erregten Tieren resultiert oft in Chromosomen-Präparationen von minderer Qualität!
- Die Heparin-Blutprobe darf nicht gekühlt oder eingefroren werden!
- Die Präparation von Chromosomen ist einfacher aus Blutproben als aus Biopsien
- Für DNA-Analysen muss auch eine EDTA-Blutprobe des Patienten eingeschickt werden!
- Die klinischen Befunde müssen mit dem Blut (ungekühlt per Express) eingeschickt werden!
Im Labor erfolgt die Chromosomen-Präparation nach Kultivierung von Lymphozyten (Abbildung 1) aus dem Blut (Kurzzeit-Kultur) oder von Fibroblasten aus Biopsien (Langzeit-Kultur). Heparinisiertes Vollblut oder Stanzbiopsien eignen sich sehr gut. Die Kurzzeit-Lymphozytenkultur ist vom Arbeits- und Kostenaufwand her vorzuziehen. Bei bestimmten Fragestellungen können aber auch Langzeit-Kulturen hergestellt werden.
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- Die heparinisierte Blutprobe wird mit einem Kulturmedium gemischt und als Zusatz wird ein pflanzliches Mitogen beigegeben, das die Lymphozyten zur Zellteilung stimuliert.
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- Nach einer Kultivierung von 72 Stunden in einem Kulturschrank sind viele Lymphozyten in der Prometaphase oder Metaphase der Zellteilung.
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- Kolchizin wird zugegeben, um die Mitosen zu arretieren.
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- Die hypotone Behandlung der Zellen führt zu einer Lysis der Erythrozyten und zu einem Anschwellen der Lymphozyten (ohne Lysis).
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- Die Fixierung der Lymphozyten-Kerne und deren Chromosomen erfolgt durch eine Behandlung mit einem Gemisch mit Eisessig und Methanol.
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- So fixierte Chromosomen können bei -20°C bis -80°C gelagert werden, und bei Bedarf können Aliquots zur Chromosomen-Untersuchung entnommen werden
Ablauf einer Chromosomen-Präparation aus Lymphozyten.
Von der Chromosomen-Präparation werden Aliquots auf einen Objektträger aufgetropft. Unter dem Mikroskop sind dann viele Interphasen-Kerne und sogenannte Metaphasen sichtbar (Abbildung 2). Eine Metaphase ist der Bereich, in dem die kondensierten Chromosomen eines einzelnen Zellkerns liegen. Die Identifizierung der einzelnen Chromosomen erfolgt durch unterschiedliche Bänderungsmuster. Es gibt Haustierarten, deren Chromosomen relativ einfach zu unterscheiden sind, wie die des Hausschweins, und andere, deren Chromosomen mit Bänderungstechniken allein nicht identifiziert werden können (z.B. Haushund). In solchen Fällen müssen molekulare zytogenetische Methoden miteinbezogen werden wie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen (FISH). Für die meisten Haustierarten stehen international standardisierte und anerkannte Beschreibungen der Chromosomen zur Verfügung.
In der Mitte der Abbildung ist eine Metaphase nach QFQ-Bänderung mit allen Chromosomen eines Lymphozyten-Zellkerns zu sehen. Die drei runden Gebilde stellen Interphasen-Kerne von Leukozyten dar.