Molekulare zytogenetische Methoden

Grosse Deletionen, Duplikationen, Inversionen und Translokationen, die DNA-Segmente von ca. 5-10 Millionen Basenpaare oder mehr umfassen können normalerweise nach konventioneller Bänderung der Chromosomen nachgewiesen werden. Dazu braucht es Chromosomen-Präparationen von guter Qualität mit gut gestreckten Chromosomen. Umfasst die Veränderung einen kleineren Abschnitt eines Chromosoms oder ist die Veränderung sehr komplex, reichen Bänderungsmuster der Chromosomen normalerweise nicht mehr aus, um eine exakte Beschreibung der Veränderung zu machen. Für solche Fälle müssen je nach der Fragestellung andere Techniken eingesetzt werden. Eine der wichtigsten Methoden ist die in situ Hybridisierung. Sie wird im Folgenden erklärt.

In Situ Hybridisierung (ISH)

Unterschiedliche Techniken der in situ Hybridisierung (ISH) können eingesetzt werden, um Gene zu kartieren und um einfache oder komplexe chromosomale Aberrationen besser charakterisieren zu können. Dazu werden oft BAC-Klone oder andere bekannte DNA-Sequenzen für spezifische Gene oder genetische Marker als DNA-Sonden eingesetzt.

Bevor die Hybridisierung durchgeführt wird, müssen die Chromosomen durch ein Bänderungsmuster identifiziert werden. Die Resultate (Fotografien) werden in einem Datenfile gespeichert, um später die Resultate der Hybridisierung korrekt einem Chromosomenpaar zuweisen zu können.

Damit eine Hybridisierung stattfinden kann, müssen die markierte DNA-Sonde und die DNA der Chromosomen (Target-DNA) vorgängig denaturiert werden, d.h. die komplementären Stränge müssen getrennt werden. Die auf dem Objektträger fixierten Chromosomen werden von RNA befreit und durch eine Formamid-Behandlung bei ca. 72°C denaturiert. Die DNA-Sonde wird direkt im Hybridisierungsbuffer, der ebenfalls Formamid enthält, bei derselben Temperatur denaturiert. Die denaturierte DNA-Sonde wird dann auf die Metaphasen-Chromosomen aufgetropft und das Ganze mit einem Deckglas und Rubber Cement versiegelt. Die Hybridisierung erfolgt in einer Feuchtekammer bei 37°C für mindestens 18 Stunden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Deckglas entfernt und die Metaphasen werden von nicht gebundenen Molekülen der DNA-Sonde befreit. Der Nachweis der markierten DNA-Sonde, die an die chromosomale DNA gebunden hat, kann direkt oder indirekt erfolgen. Dazu wird ein Fluoreszenz-Mikroskop mit verschiedenen Filtern benötigt.