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Die Paillette wird in den vorderen Abschnitt des aufgewärmten Katheters verbracht und durch Abschneiden des vorstehenden Endes mit einer Schere eröffnet. Danach wird eine Plastikhülle über den Katheter geschoben und durch Ring- oder Drehverschluss fixiert. Das besamungsbereite Tier wird fixiert, nach Möglichkeit wird der Schwanz durch eine Hilfsperson seitlich der Kuh gehalten.
Der Katheter wird sauber in die Vagina eingeführt und unter rektaler Kontrolle durch die Cervix bis in den Uteruskörper vorgeschoben. Der Mandrin im Katheter schiebt den Baumwollstopfen in der Paillette vor und das Sperma fliesst aus. Der Katheter kann nun sorgfältig aus der Vagina entfernt und auf allfällige Blut- oder Eiterspuren untersucht werden.
Das Sperma wird im Bereich des Corpus uteri deponiert. Da die Cervixbarriere umgangen wird, reicht eine Spermienzahl von zehn bis zwanzig Millionen Spermien pro Dose aus, dies im Gegensatz zum Natursprung, bei welchem etwa 1-5 Milliarden Spermien caudal der Cervix abgegeben werden.
Zeigt das Tier (meist 3 Wochen) nach einer ersten Besamung Brunstanzeichen, findet eine Nachbesamung statt. Der Katheter wird für den Fall einer Trächtigkeit aber nur bis zum cranialen Ende der Cervix eingeführt und das Sperma dort abgegeben.
Die Befruchtung erfolgt im Eileiter am Übergang vom Isthmus zur Ampulle. Nach einer Besamung braucht es ungefähr acht Stunden, bis genügend Spermien diesen Ort erreicht haben. Da die Eizelle weniger lange befruchtungsfähig ist als die Spermien, sollten die Spermien die Eizelle im Eileiter erwarten. Der ideale Besamungszeitpunkt liegt also vor der Ovulation, in der zweiten Brunsthälfte. In der Praxis wird meist die Morgen/Abend Regel angewandt: Befindet sich eine Kuh am Morgen in der Brunst, wird sie am Nachmittag besamt, ist sie am Morgen darauf noch immer brünstig, wird sie erneut besamt. Wird die Kuh am Nachmittag oder am Abend brünstig, erfolgt die Besamung am nächsten Morgen.
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