4.11 Ablauf eines ET-Programms
am Beispiel des Rindes

• Einleitung
• Superovulation
  • Protokolle
• Besamung
• Synchronisation von Empfängertieren
• Gewinnung der Embryonen durch Spülung der Gebärmutter
• Beurteilung von Embryonen
  • Beurteilung des Entwicklungsstadiums
  • Beurteilung der Qualität
  • Splitting
• Konservierung - Direktübertragung
• Konservierung - Kryokonservierung
  • Auftauen
  • Auswaschen der Kryoprotektiva
• Transfer
• Bedeutung

Konservierung - Direktübertragung

Die transfertauglichen Embryonen können nun entweder direkt auf ein vorbereitetes Empfängertier übertragen oder gelagert werden. In Kulturmedien sind Embryonen kurzzeitig (für Stunden) haltbar. Strebt man eine langfristige Konservierung an, müssen die Embryonen tiefgefroren werden.

Die theoretischen Grundlagen zur Kryokonservierung werden im Kapitel Kryokonservierung behandelt (siehe Kapitel Kryokonservierung von Spermien und Embryonen).

Konservierung - Kryokonservierung

Ein heute weit verbreitetes Protokoll zur Kroykonservierung von Rinderembryonen basiert auf einer Abkühlrate von ca. -0.5°C/min bis -0.6°C/min. Diese Rate wird bis zu -35°C beibehalten (Verhindern der intrazellulären Kristallbildung) und die Embryonen werden anschliessend in flüssigen Stickstoff (-196°C) transferiert. Als Gefrierschutzmedien haben sich Glycerol und Ethylenglykol durchgesetzt.

Rinderembryonen scheinen das Einfrieren und Auftauen besser zu ertragen als Embryonen anderer Spezies. Ein möglicher Grund dafür dürfte im geringen Gehalt an Triglyceriden im Rinderembryo liegen, gestaltet sich doch die Kryokonservierung umso schwieriger, je mehr dieser Lipide ein Embryo enthält.

Die Trächtigkeitsrate nach Transfer gefrorener Embryonen (60%) ist kaum geringer als bei frisch transferierten Embryonen (60-65%). Dank dieser Tatsache wird der Embroytransfer beim Rind breit und vor allem auch international eingesetzt.

Auftauen

Der tiefgekühlte Embryo muss vor dem Transfer wieder aufgetaut werden.
Dabei empfiehlt sich das schnelle Auftauen, wenn die Embryonen mittels schneller oder ultraschneller Tiefkühltechnik oder Vitrifikation gefroren wurden. Dabei schmelzen die kleinen Eiskristalle so rasch, dass sie sich nicht zu schädigenden Konglomeraten zusammenlagern können.

Bewährt hat sich das Auftauen durch das sechs Sekunden lange Halten in der Luft, gefolgt von 20 Sekunden im 37°C warmen Wasserbad.

Abb. 37
Auftauen eines tiefgekühlten Embryos durch Eintauchen der Paillette in ein Wasserbad.

Auswaschen der Kryoprotektiva

Nahezu alle Kryoprotektiva wirken bei wärmeren Temperaturen toxisch auf den Embryo. Deshalb muss vor dem Transfer noch die Ausverdünnung stattfinden. Je nach gewählten Kryoprotektiva werden unterschiedliche Protokolle benutzt.
Bewährt hat sich die Ausverdünnung von Glycerin mittels Sucrose in einem oder mehreren Schritten. Der Embryo wird dabei ohne gezieltes Auftauen aus der Paillette entnommen und in eine Sucrose-Lösung gegeben, bevor er in eine Paillette retourniert und transferiert wird.
Wird bei der Tiefkühlung Ethylenglykol als Kryoprotektivum verwendet, entfällt dank seines tiefen Molekulargewichts, das die schnellere Penetration aus dem Embryo erlaubt, das Ausverdünnen. Ein zeitsparender Direkttransfer nach dem Auftauen ist also möglich. Diese Methode hat sich in der Praxis sehr gut bewährt und weitgehend durchgesetzt.